Antygen - reakcja przeciwciał

Specyficzna interakcja przeciwciał z odpowiednimi antygenami, w wyniku której powstają kompleksy antygen-przeciwciało (kompleksy immunologiczne). Często końcowym rezultatem tej reakcji jest wiązanie toksyn, unieruchomienie wirulentnych bakterii i neutralizacja wirusów. Miejsca wiązania antygenu w cząsteczce przeciwciała mogą wiązać kilka niespokrewnionych antygenów. Te antygeny są strukturalnie podobne i nazywane są antygenami reagującymi krzyżowo. Jednorodna populacja cząsteczek przeciwciał może wiązać różne cząsteczki z bardzo małym podobieństwem strukturalnym lub bez takiego podobieństwa. W tym przypadku mówią o wiązaniu wielospecyficznym, co tłumaczy się tworzeniem wiązań w różnych miejscach w centrach wiążących antygen..

Reakcja antygen-przeciwciało przebiega w dwóch fazach, różniących się mechanizmem i szybkością. Pierwsza faza to specyficzne połączenie aktywnego centrum przeciwciała z odpowiednimi grupami antygenu lub haptenu (patrz. Antygeny); druga, niespecyficzna faza następująca po pierwszej, jest reakcją obserwowaną wizualnie. Kiedy przeciwciała oddziałują z prostymi haptenami, druga faza jest zwykle nieobecna. W pewnych warunkach, na przykład przy braku soli, pierwsza faza może wystąpić, ale druga nie. Pierwsza faza jest zawsze szybka, a druga czasami bardzo wolna.

Wiązanie antygen-przeciwciało jest odwracalne; siłę wiązania, zwaną powinowactwem, można określić ilościowo, określając stałą asocjacji. Istnieje również termin awidność przeciwciał, który jest używany do opisania całkowitej siły interakcji wielowartościowego przeciwciała z antygenem polideterminującym.

W większości przypadków populacje przeciwciał pojawiające się w surowicy immunizowanych zwierząt stanowią heterogenny zestaw cząsteczek o różnych miejscach wiązania antygenu i różnym powinowactwie do antygenu. Heterogeniczność populacji przeciwciał pod względem powinowactwa i specyficzności odzwierciedla heterogeniczność komórek wydzielających przeciwciała. Każda komórka produkująca przeciwciała wytwarza jednorodną populację cząsteczek. Często zauważa się, że wraz z upływem czasu po immunizacji następuje wzrost średniego powinowactwa przeciwciał. To „dojrzewanie odpowiedzi immunologicznej” odzwierciedla selekcję komórek, które tworzą więcej przeciwciał powinowactwa i pozwala bardzo małej ilości przeciwciał skuteczniej reagować z antygenem i tworzyć mechanizmy obronne organizmu, gdy mikroorganizmy ponownie do niego wejdą.

Badając mechanizm interakcji przeciwciał z antygenem za pomocą spektropolarymetrii i innych metod fizykochemicznych stwierdzono, że w momencie wiązania haptenu przez przeciwciało następuje przegrupowanie konformacyjne cząsteczki przeciwciała. W tym przypadku cząsteczka przeciwciała staje się bardziej odporna na działanie różnych czynników denaturujących, a także na hydrolizę przez enzymy proteolityczne. Oczywiście w procesie wiązania determinującej grupy antygenu następuje adaptacyjna rearanżacja aktywnego centrum przeciwciała.

Oddziaływaniu przeciwciała z cząsteczką antygenu towarzyszą z kolei zmiany w strukturze przestrzennej antygenu. W ten sposób metmioglobina jest przekształcana w apomioglobinę w wyniku kompleksowania z przeciwciałem skierowanym przeciwko apomioglobinie, a pozbawiona aktywności β-galaktozydaza jest przekształcana w aktywny enzym w wyniku reakcji z przeciwciałami na aktywną postać β-galaktozydazy. Tak więc, gdy antygen oddziałuje z przeciwciałem, oba związki mają wzajemny wpływ na własną konformację przestrzenną. Wynikające z tego zmiany konformacyjne są odwracalne. Przeciwciała wyekstrahowane z kompleksów immunologicznych zachowują aktywność wiązania antygenu i nie różnią się właściwościami chemicznymi i fizycznymi od przeciwciał natywnych.

Charakter reakcji zachodzących w drugiej fazie A. - a. p., w dużej mierze determinują właściwości fizyczne antygenu i przejawia się w postaci kilku podstawowych zjawisk (aglutynacja, neutralizacja toksyn i wytrącanie).

Zjawisko aglutynacji polega na tym, że mikroorganizmy, komórki zwierzęce lub inne cząsteczki antygenów korpuskularnych w zawiesinie są sklejane pod wpływem przeciwciał. Reakcja aglutynacji znalazła szerokie zastosowanie do oznaczania ludzkich grup krwi, czynnika Rh, ilościowego oznaczania przeciwciał i antygenów.

Reakcja neutralizacji toksyn opiera się na właściwościach antytoksyn (przeciwciał przeciwko toksynom), które w połączeniu z odpowiednimi substancjami toksycznymi je neutralizują. Stopień neutralizacji można wyjaśnić podając podatnemu zwierzęciu mieszaninę toksyn i antytoksyny. Ilość antytoksyny w surowicy odpornościowej charakteryzuje się ilością minimalnych śmiertelnych dawek toksyny, które mogą zostać zneutralizowane przez określoną ilość surowicy. Reakcja neutralizacji służy do określenia stężenia toksyn czynników wywołujących błonicę, tężec itp. W tym celu stosuje się standaryzowane surowice antytoksyczne.

Zjawisko wytrącania polega na tworzeniu nierozpuszczalnych kompleksów antygen-przeciwciało w wyniku połączenia rozpuszczalnego antygenu ze swoistymi przeciwciałami i wytrącenia tego kompleksu. Szczególnym przypadkiem reakcji strącania jest reakcja flokulacji immunologicznej, która występuje tylko w stosunkowo wąskim zakresie stężeń antygenu, a przy niewielkim nadmiarze przeciwciał i antygenu tworzą się rozpuszczalne kompleksy. Reakcja strącania służy do ilościowego oznaczania antygenów i przeciwciał, stężenia immunoglobulin różnych klas we krwi ludzi, w kryminalistycznym badaniu lekarskim w celu określenia gatunku białek surowicy krwi w reakcji Chistovich - Ulengut.

Zdolność przeciwciał do łączenia cząstek antygenowych w duże konglomeraty (aglutynacja komórek bakteryjnych i innych, wytrącanie rozpuszczonych antygenów) wynika z obecności co najmniej dwóch aktywnych centrów w cząsteczce przeciwciała. Jedna specyficzna grupa wiąże się z jedną determinantą antygenową, druga - z podobną determinantą innej cząsteczki antygenowej. Dwuwartościowość przeciwciał umożliwia łączenie nieograniczonej liczby cząstek antygenowych w konglomeraty. Przy różnej liczbie determinant antygenowych na cząsteczce antygenu, natura struktury konglomeratów kompleksu antygen-przeciwciało może być różna. Przy nadmiarze antygenu lub przeciwciał duże konglomeraty nie pojawiają się w ogóle z powodu wypełnienia reagujących regionów cząsteczek nadmierną ilością drugiego składnika. W rezultacie A. - a. R. manifestują się maksymalnie tylko w pewnym zakresie stężeń obu odczynników, w tzw. strefie równoważności.

Interakcja antygenu z przeciwciałem prowadzi do realizacji szeregu biologicznych (efektorowych) funkcji przeciwciał. Obejmują one zjawisko wiązania dopełniacza, lizy, cytotoksyczności zależnej od przeciwciał i opsonizacji.

Zjawisko wiązania dopełniacza polega na dodaniu dopełniacza do kompleksu antygen-przeciwciało. Dopełniacz to wieloskładnikowy samoorganizujący się system białek krwi, który odgrywa jedną z kluczowych ról w utrzymaniu homeostazy immunologicznej. Aktywacja układu dopełniacza, wywołana przez A. - a. R., towarzyszą liczne naruszenia homeostazy związane przede wszystkim z uszkodzeniem komórek lub zmianami ich funkcji. Tylko dwie klasy przeciwciał (lgG i lgM) zapewniają aktywację układu dopełniacza. W zależności od swoistości przeciwciał, rodzaju komórek docelowych, liczby i charakteru składników dopełniacza biorących udział w reakcji, można zaobserwować nieodwracalne uszkodzenie błony komórkowej, zwiększa się podatność na fagocytozę, uwalniane są środki farmakologiczne, takie jak histamina, oraz może wystąpić ukierunkowana migracja komórek (chemotaksja). Reakcja wiązania dopełniacza opiera się na zdolności dopełniacza do przyłączania się do kompleksu antygen-przeciwciało, który jest stosowany w diagnostyce kiły (reakcja Wassermana), zadowoleniu z infekcji wirusowych, badaniu przeciwciał przeciw tkankom i autoprzeciwciał.

Zjawisko lizy polega na zdolności niektórych przeciwciał w obecności dopełniacza do rozpuszczania komórek, z których pochodzą. Zjawisko cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał polega na lizie kontaktowej komórek zabójców (komórek K) obcych komórek opłaszczonych przeciwciałami IgG. Ten proces jest niezależny od systemu dopełniacza. Zjawisko opsonizacji polega na tym, że przeciwciała zwiększają aktywność fagocytarną neutrofili i makrofagów w stosunku do tych antygenów, przeciwko którym są uzyskiwane.

Bibliografia: Boyd W. Fundamentals of Immunology, tłum. z angielskiego., M., 1969; Veisman I.L. Kaptur L.E. and Wood, W.B. Wprowadzenie do immunologii, tłum. z angielskiego, s. 66, M., 1983; Immunology, wyd. W. Paul, tłum. z angielskiego, t. 1, M., 1987; Kulberg A.Ya. Molecular Immunology, str. 91, M., 1985; Cabot E. i Meyer M. Experimental immunochemistry, tłum. z angielskiego., M., 1968; R.V. Petrov Immunology, s. 36, M., 1987.

Wszystko o przeciwciałach przeciw erytrocytom

Okres ciąży dla każdej przyszłej mamy jest wspaniały i jednocześnie ekscytujący. Niosąc swoje ukochane dziecko pod sercem, każda kobieta doświadcza i pragnie łatwej ciąży i porodu. Ale matki z ujemnym Rh mogą napotkać pewne pytania dotyczące ich krwi Rh ujemnej i zdrowia ich dziecka..

Przeciwciała przeciw erytrocytom - co to jest?

Erytrocyty Rh-dodatnie i Rh-ujemne

Przeciwciała to związki białkowe w osoczu krwi, które są wytwarzane w odpowiedzi na obecność określonego antygenu. Poprzez interakcję przeciwciało i antygen razem tworzą kompleks immunologiczny, który wyzwala określone reakcje w układzie odpornościowym organizmu. Jeśli mówimy o przeciwciałach przeciwko erytrocytom, mamy na myśli związki białkowe, które są wytwarzane w odpowiedzi na antygeny na powierzchni czerwonych krwinek. Najczęściej rolą antygenów erytrocytów jest czynnik Rh, który w istocie jest białkiem na błonie erytrocytów. Z tego można wyciągnąć prosty i zrozumiały wniosek, którzy są pacjentami Rh-ujemnymi i Rh-dodatnimi. Pacjenci Rh-dodatni mają białko na powierzchni erytrocytów, u pacjentów Rh-ujemnych nie ma takiego białka.

Kiedy tworzą się przeciwciała?

Transfuzja krwi może spowodować produkcję przeciwciał

Jeśli przejdziemy do immunologii, okaże się, że przeciwciała powstają po tym, jak limfocyty napotkają obce antygeny, które dostały się do organizmu. Tworzenie takich obcych antygenów jest możliwe w następujących przypadkach:

Transfuzja krwi lub transfuzja krwi. W organizmie pacjenta wymagającego transfuzji krwi (biorcy) czerwone krwinki dawcy są rozpoznawane przez układ odpornościowy jako obce antygeny (środki). W odpowiedzi na nie zaczynają być wytwarzane przeciwciała przeciwko erytrocytom..
Ciąża. W czasie ciąży czerwone krwinki Rh-dodatnie płodu mogą dostać się do krwiobiegu matki Rh-ujemnej przez łożysko. Jej organizm rozpoznaje to białko na powierzchni erytrocytów dziecka jako obcy antygen i wytwarza w odpowiedzi przeciwciała przeciw rezusowi.

Zarówno podczas transfuzji krwi, jak i podczas pierwszej ciąży ilość syntetyzowanych przeciwciał jest niewielka, więc nie mogą one mieć szkodliwego wpływu na organizm. Jednak układ odpornościowy ma swego rodzaju „pamięć” dzięki limfocytom B. Dlatego druga ciąża lub kolejna transfuzja krwi nie pozostają niezauważone. W odpowiedzi na te okoliczności zaczyna syntetyzować ogromną ilość przeciwciał, co może prowadzić do niebezpiecznych zmian w organizmie człowieka. W przypadku ciąży może to być jej poronienie..

Rodzaje przeciwciał

Mechanizm powstawania immunologicznych przeciwciał przeciw erytrocytom

Istnieją dwa rodzaje przeciwciał przeciwko erytrocytom - naturalne i immunologiczne.

Naturalne (regularne) przeciwciała przeciw erytrocytom są zawsze tworzone i są wrodzone i powstają w odpowiedzi na antygeny przeciw erytrocytom z układu ABO.
Przeciwciała immunologiczne (nieregularne), w przeciwieństwie do tych pierwszych, powstają, gdy do organizmu dostanie się obcy czynnik - powyższe przypadki z ciążą i transfuzją krwi. Inna nazwa takich związków białkowych to alloimmunologiczny lub izoimmunologiczny. Te przeciwciała reagują nie ze swoimi własnymi, ale z obcymi antygenami przedostającymi się do organizmu człowieka. Oprócz powyższego istnieje koncepcja stałych przeciwciał lub autoprzeciwciał. Z ostatniego słowa jasno wynika, że przeciwciała te są wytwarzane przeciwko antygenom ich własnych erytrocytów pod wpływem pewnych czynników. Podobną sytuację można zaobserwować w przypadku chorób hemolitycznych noworodków, niedokrwistości lekowej autoimmunologicznej itp..

W sumie powierzchnia erytrocytów zawiera około 100 antygenów, które reprezentują 19 oddzielnych układów. Czynnik Rh jest najbardziej immunogenny. Oznacza to, że w odpowiedzi na to reakcja układu odpornościowego jest najbardziej wyraźna..

Test przeciwciał

Istota reakcji aglutynacji

Test do oznaczania przeciwciał opiera się na reakcji aglutynacji. Charakteryzuje się tworzeniem kłaczków lub osadu, na który reagują przeciwciała z antygenami. Do badania pobiera się krew żylną. Oznaczenie przeciwciał przeciwko erytrocytom jest wskazane w następujących przypadkach:

określenie zgodności dawcy i biorcy przed wykonaniem transfuzji krwi;
identyfikacja możliwego konfliktu Rh u matki i płodu.

Przygotowanie do testu nie jest czymś wyjątkowym i składa się z następujących prostych zaleceń, które są łatwe do przestrzegania. Oto, na co musisz zwrócić uwagę:

Konieczne jest oddawanie krwi rano i na czczo. W ten sposób można przeprowadzić test na tle ograniczonego spożycia płynów. Ostatni posiłek powinien być nie później niż osiem godzin przed rozpoczęciem testu.
Nie zaleca się spożywania potraw smażonych lub pikantnych dzień wcześniej, spożywania alkoholu.
W przeddzień zaleca się wykluczenie jakiejkolwiek aktywności fizycznej. Przed badaniem pacjenci powinni odpoczywać przez co najmniej pół godziny. Oznacza to, że musisz przyjść trochę wcześniej niż wyznaczona godzina i usiąść.
Unikaj palenia w ostatnich 30 minutach przed przystąpieniem do testu.

Wykonanie i interpretacja testów

Dekodowanie testu aglutynacji

Etap pierwszy: do jednej probówki wprowadza się erytrocyty dawcy i surowicę biorcy (pacjenta). Jeśli obecne są przeciwciała, są one utrwalane na powierzchni czerwonych krwinek.
Drugi etap: przereagowane lub nieprzereagowane erytrocyty są przenoszone do szkła. Dodaje się również standardową surowicę antyglobulinową z przeciwciałami przeciwko ludzkiej immunoglobulinie. Jeśli przeciwciała są utrwalone na erytrocytach, obserwuje się dodatnią reakcję aglutynacji - osad lub płatki. W przeciwnym razie reakcję uznaje się za negatywną..

W zależności od siły reakcji aglutynacji rozróżnia się następujące wyniki:

mocny pozytyw lub 4 plus,
pozytywny lub 3 plus,
słabo pozytywne - 2 plusy,
bardzo słabo pozytywny - 1 plus,
ujemny - minus.

Czy przeciwciała przeciw erytrocytom są normalne? Tak, są, ale w bardzo małych ilościach, których nie można określić konwencjonalnymi metodami. Przed przystąpieniem do interpretacji testu należy pamiętać, że wynik testu może być pozytywny, jeśli kobieta otrzymała zastrzyk z antyrezusem i immunoglobuliną w ciągu ostatnich 6 miesięcy. Ponadto negatywny wynik u dziecka można również zaobserwować, gdy reakcja jest pozytywna..

Przeciwciała przeciwko antygenom

SYSTEM ODPORNOŚCIOWY MAKROORGANIZMU

Wykład numer 7

Specyficzne mechanizmy obronne / odporność nabyta, odpowiedź immunologiczna / implikują rozpoznanie przez komórki układu odpornościowego genetycznie obcych substancji / antygenów / i specyficzną odpowiedź na nie, która może objawiać się w postaci kilku reakcji:

- tworzenie przeciwciał / immunoglobulin /

- tolerancja immunologiczna / specyficzna nieodpowiedzialność /

- natychmiastowa nadwrażliwość / alergia /

- nadwrażliwość typu opóźnionego / alergia /

- interakcja idiotyp-antyidiotypowa. Te reakcje i ogólna odpowiedź immunologiczna są funkcją układu odpornościowego..

Układ odpornościowy to zbiór wszystkich narządów limfoidalnych i komórek, które tworzą jeden rozproszony organ odporności. Komórki tego narządu stale krążą w krwiobiegu w całym organizmie. Główną komórką układu odpornościowego jest limfocyt. Centralnymi narządami układu odpornościowego są grasica / grasica / i szpik kostny. Zachodzi w nich różnicowanie, tj. rozwój i „trening” limfocytów, które stają się odpowiednio limfocytami T i limfocytami B. Obwodowe narządy odporności - śledziona, węzły chłonne, pęcherzyki limfatyczne / blaszki /, monocyty krążące we krwi. W tych narządach powstaje specyficzna odpowiedź immunologiczna. Odpowiedź immunologiczna jest prowadzona przez immunokompetentne komórki / immunocyty /, tj. Limfocyty T, limfocyty B i makrofagi, w trakcie ich współpracy z udziałem mediatorów / pośredników chemicznych /.

Rozróżnić między humoralną odpowiedzią immunologiczną / wytwarzaniem przeciwciał, tworzeniem się alergii typu natychmiastowego / i komórkową odpowiedzią immunologiczną związaną z gromadzeniem się uczulonych limfocytów T / nadwrażliwością typu opóźnionego itp. /.

Odpowiedź immunologiczna jest kontrolowana przez geny regionu I szóstej pary ludzkich chromosomów. Wyzwalaczem każdej reakcji immunologicznej jest kontakt układu odpornościowego z antygenem..

Antygeny to substancje niosące oznaki obcości genetycznej, a wprowadzone do organizmu powodują rozwój reakcji immunologicznych. Jeśli substancja wywołuje alergię, nazywana jest alergenem. Warunki, w których substancja może być antygenem:

I / obcość / w odniesieniu do układu odpornościowego konkretnego organizmu /

2 / wystarczająco duża masa cząsteczkowa / ponad 10 kilodaltonów /

3 / raczej złożona konstrukcja

4 / sztywny układ grup determinujących w cząsteczce

5 / dobra rozpuszczalność w wewnętrznym środowisku organizmu.

Antygeny to: białka różnego pochodzenia, złożone polisacharydy, lipopolisacharydy, kompleksy białek z lipidami lub kwasami nukleinowymi. Nie są to antygeny: proste związki nieorganiczne i organiczne, lipidy, czyste preparaty kwasów nukleinowych. Następujące właściwości są charakterystyczne dla antygenów wysokiego stopnia: obcość, antygenowość, immunogenność i swoistość. Obcy jest znakiem / "pieczęcią" / pracy obcego genomu / organizmu /. Występuje na wysokim poziomie organizacji biocząsteczek / np. Jest nieobecny w aminokwasach lub peptydach, ale pojawia się w złożonych białkach /. „Obcość jest względna / albumina białka króliczego nie jest obca dla królika, ale obca dla myszy lub świnki morskiej /. Antygenowość - zdolność do wywoływania reakcji immunologicznych o większym lub mniejszym nasileniu / np. Globulina ma większą antygenowość niż albumina, ponieważ po wprowadzeniu globuliny powstaje więcej przeciwciał /. Immunogenność - zdolność do wywoływania odporności / odporności na drobnoustroje lub toksyny /.Np. antygeny czynnika wywołującego dur brzuszny lub odrę są bardziej immunogenne niż antygeny czynnika wywołującego czerwonkę, po której nie ma trwałej odporności i występują choroby nawracające. jak antygeny różnią się od siebie. Jest określane przez ich budowę chemiczną. Najbardziej istotne grupy chemiczne dla specyficzności / determinanty antygenowe /: posiadają hydrofilowość, skupiają pewien ładunek i są zorientowane na zewnątrz. Liczba determinantów antygenowych / wartościowości / przyłączania I do cząsteczki przeciwciała, w różnym stopniu a ntigens waha się od 10 do 1000 lub więcej.

Następujące typy antygenów wyróżnia się specyficznością:

I / gatunek antygenu, jest określony u wszystkich przedstawicieli tego gatunku i nie występuje u przedstawicieli innych gatunków / u drobnoustrojów, zwierząt, ludzi, można go wykryć w reakcji z immunologią gatunkową

2 / typ antygenu, powoduje różnicę między osobnikami tego samego gatunku; Na przykład czynnik czerwonki Flexnera ma 6 wariantów antygenowych - serowary. U ludzi rozróżnia się ponad 70 izoantygenów, które powodują różnice w grupach krwi, czynniku Rh i antygenach zgodności tkankowej. Niedopasowanie izoantygenów dawcy i biorcy może być przyczyną odrzucenia przeszczepionej tkanki lub narządu,

3 / heterogeniczny antygen, jest wspólny dla przedstawicieli różnych gatunków; tak więc czynnik wywołujący dżumę i inne drobnoustroje mają wspólne antygeny z ludzkimi tkankami / mimkria antygenowa /; wspólne antygeny mogą występować u przedstawicieli różnych typów drobnoustrojów należących do tej samej rodziny lub bardzo odrębnych / grupowych antygenów /,

4 / autoantygeny to substancje, które mogą uodpornić ten organizm

z którego pochodzą. Normalne autoantygeny to tkanki

organizmy, które normalnie nie wchodzą w kontakt z układem odpornościowym

/ mózg, soczewka oka, jądra /; mogą uodpornić organizm w przypadku kontuzji. Patologiczne autoantygeny mogą być patologicznie zmienionymi tkankami po odmrożeniach, oparzeniach, naświetlaniu, działaniu toksyn drobnoustrojów.

Wszystkie antygeny można podzielić na pełnoprawne, posiadające wszystkie właściwości antygenu oraz wadliwe / hapteny /. Hapteny to substancje, które po wprowadzeniu do organizmu nie są w stanie wywołać reakcji immunologicznych, ale wchodzą w specyficzne reakcje z gotowymi przeciwciałami lub immunocytami. Hapteny stają się pełnoprawnymi antygenami po powiększeniu cząsteczki / połączeniu z białkiem, polisacharydem lub innym nośnikiem /. Haptenami mogą być: proste polipeptydy, lipidy, kwasy nukleinowe, proste substancje organiczne, antybiotyki, formaldehyd, itp. Proste hapteny podczas interakcji z odpowiednimi przeciwciałami nie dają widocznej reakcji strącania / wytrącania /, a złożone hapteny dają / wytrącają /. Wnikając do organizmu, hapteny mogą łączyć się z jego białkami (wolnymi lub w składzie komórek) i stać się pełnoprawnymi antygenami, uodparniając organizm. Może to prowadzić do stanów patologicznych / kontaktowego zapalenia skóry u pracowników przy produkcji antybiotyków lub witamin, reakcji alergicznych po podaniu leków; jeśli hapten wykazuje powinowactwo do krwinek, może rozwinąć się niedokrwistość, leukopenia lub plamica /.

Antygeny drobnoustrojów. Należą do nich: całe komórki drobnoustrojów / zabite i żywe /, toksyny, produkty rozpadu komórek wyekstrahowane z komórek frakcji. W strukturze antygenowej komórki drobnoustroju występują: antygen H / antygen białkowy wici /, antygen K / białko powierzchniowe lub antygen błony polisacharydowej /, antygen O / lipopolisacharyd ściany komórkowej, antygen somatyczny /, antygeny cytoplazmatyczne. Antygen o najwyższej antygenowości i immunogenności nazywany jest antygenem ochronnym drobnoustroju, który po podaniu przyczynia się do powstania stabilnej odporności. Dlatego do szczepionek wprowadza się antygeny ochronne. Cele badania antygenów drobnoustrojów:

- określenie typu i wariantu / identyfikacji / patogenu na podstawie struktury antygenu,

- szybkie wskazanie / wykrycie / obecność drobnoustrojów w badanym materiale metodami immunologicznymi / przy użyciu preparatów immunoglobulin

- projektowanie preparatów antygenowych / diagnostyka, alergeny / do diagnostyki chorób zakaźnych poprzez odpowiedź immunologiczną organizmu / serodiagnostyka - wykrywanie przeciwciał, diagnostyka alergii - wykrywanie uczulonych limfocytów,

- tworzenie szczepionek i surowic do zapobiegania i leczenia infekcji.

Preparaty antygenów drobnoustrojów można otrzymać z płynu hodowlanego / wydzielanego / lub poprzez różnego rodzaju działanie na komórki / ogrzewanie - antygen 0, obróbka formaliną - antygen H; stosować również dezintegrację ultradźwiękową, frakcjonowanie, ekstrakcję chemiczną itp. /. Antygeny mogą być tworzone in vitro poprzez syntezę chemiczną / syntetyczne antygeny /.

Przeciwciała to białka pochodzenia zwierzęcego, tworzone przez narządy limfoidalne kręgowców podczas wprowadzania antygenów i zdolne do specyficznej interakcji z nimi. Różnią się szczególną budową i właściwościami, są częścią frakcji gamma-globulin surowicy krwi, dlatego nazywane są immunoglobulinami..

Właściwości przeciwciał: swoistość i szereg cech fizykochemicznych Specyficzność - zdolność do reagowania tylko z antygenem, który spowodował ich powstanie.

Właściwości fizykochemiczne; a / względna stabilność termiczna, b / względna odporność na działanie proteaz, c / odporność na denaturację etanolem w temperaturze 0-4 ° C, g / wytrącony bez denaturacji solami obojętnymi / siarczanem amonu itp. /. Właściwości te wykorzystuje się do otrzymywania preparatów immunoglobulin.

Istnieje 5 klas immunoglobulin (Ig), różniących się masą / 150 - 900 KD /, właściwościami fizykochemicznymi, strukturą i cechami funkcjonalnymi: G, M, A, E, D. Większość immunoglobulin surowicy to przeciwciała trzech klas: IgG / 70 -80% /, IgA / 10-15% / i IgM / 5-10% /; reszta / IgE i IgD / - 0,2%.

Struktura immunogdobuliny / IgG, monomer /. IgG składa się z 4 łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami dwusiarczkowymi: pary identycznych łańcuchów ciężkich / 50 CD / i pary identycznych łańcuchów lekkich / 23 CD / z zawiasem w środku cząsteczki. Po potraktowaniu enzymem proteolitycznym papainą, IgG rozpada się na 3 fragmenty: 2 identyczne z aktywnymi centrami / grupami antydeterminantowymi / - Fab1 i Fab2, zdolne do reagowania z antygenem oraz fragment Fc / krystalizujący, stały /, który nie wiąże się z antygenem. Wolne końce / aktywne centra / obu fragmentów Fab składają się z regionów zmiennych - łańcuchów ciężkich i lekkich. Konfiguracja centrum aktywnego powtarza przestrzenną strukturę determinanty antygenowej w postaci wnęki (jak rękawiczka powtarza kształt dłoni). Pozostałe części cząsteczki są stałe, tj. mają te same sekwencje aminokwasowe w przeciwciałach o różnej specyficzności. Te miejsca / Fc / przeciwciała mogą być adsorbowane, na przykład, na specjalnych receptorach immunocytów.

IgG są dwuwartościowe - mają 2 aktywne centra, IgM są pięciowalentne - mają 5 aktywnych centrów / pentamer /.

Krótka charakterystyka klas immunoglobulin.

IgC - przeciwciała w surowicy / 150 KD /, w dużych ilościach powstają po wielokrotnym podaniu antygenu, przechodzą przez łożysko, są wysoce specyficzne, neutralizują cząsteczki drobnoustrojów i toksyny, wchodzą w interakcje z haptenami.

IgM - przeciwciała surowicy / 900 KD /, pojawiające się w 1.dniu po pierwszym kontakcie z antygenem, są mniej swoiste niż IgG, nie przechodzą przez łożysko, ale mogą znajdować się w wydzielinach na błonach śluzowych, aktywnie wiążą dopełniacz, uczestniczą w lizie komórki.

IgA - zawarte w surowicy krwi / monomerze, 170 KD / oraz w wydzielinach / mleku, na „błonach śluzowych - dimer, 430 KD /. Przechodząc / z krwiobiegu / przez nabłonek nabierają„ składnika wydzielniczego ”, który chroni cząsteczkę przed zniszczeniem enzymy wydzielin - IgA ma ogromne znaczenie w tworzeniu odporności miejscowej, zapobiegając adhezji drobnoustrojów do komórek nabłonka i kolonizacji błon śluzowych.

IgE - przeciwciała-odczynniki termolabilne w surowicy / 190 KD /; posiadają cytofilność / są utrwalone na komórkach /, przyczyniając się do rozwoju natychmiastowych reakcji alergicznych; nie przekraczać łożyska; zwiększyć przepuszczalność naczyń.

IgD - przeciwciała termolabilne w surowicy / 180 KD /, których funkcje

Rozróżnij pełne i niekompletne przeciwciała. Pełne przeciwciała mają 2 lub więcej wartościowości i tworzą złożone związki / struktury sieciowe / z antygenem. Ponieważ cząsteczka przeciwciała I może wiązać się z 2 lub więcej antygenami, prowadzi to do zmiany stanu fizykochemicznego antygenu i widocznych zjawisk - aglutynacji / flokulacji / precypitacji / precypitacji / itp. Niekompletne przeciwciała / blokujące / monowalentne, ponieważ... czy mam aktywne centrum. Nie dają struktur sieciowych i nie są wykrywane w bezpośrednich reakcjach odporności / są wykrywane metodami pośrednimi - neutralizując antygen lub w teście antyglobulinowym Coombsa /.

Dynamika gromadzenia się przeciwciał jest różna w zależności od tego, czy ten antygen przedostaje się do organizmu pierwotnie czy wtórnie. W pierwotnej odpowiedzi immunologicznej przeciwciała można wykryć we krwi 3-4 dni po ekspozycji na antygen. Jest to utajona / indukcyjna / faza immunogenezy - okres utajonej stymulacji antygenowej i współdziałania immunocytów, w wyniku którego powstają komórki plazmatyczne i gromadzą się z limfocytów B, wytwarzając przeciwciała / produktywna faza immunogenezy /. Maksymalną ilość przeciwciał obserwuje się w dniach 7-20; po tym następuje spadek miana do minimum, który następuje po 2-3 miesiącach. Od początku fazy produkcyjnej (powstają IgM, następnie dodatkowo wytwarzane są IgG i IgA, we wtórnej odpowiedzi immunologicznej występują następujące różnice: a / skrócony okres utajenia, b / szybszy wzrost stężenia przeciwciał,

c / wyższe wartości maksymalnych mian / 3 lub więcej razy /

d / produkowane przeciwciała to IgG. Zdolność do takiej wzmocnionej odpowiedzi utrzymuje się nawet przez kilka lat i jest jednym z przejawów pamięci immunologicznej, którą utrzymują w organizmie uczulone limfocyty T. Te wzorce immunogenezy leżą u podstaw nowoczesnych metod szczepienia / ponownego szczepienia /.

Interakcje antygen-przeciwciało

Laboratoryjne metody badawcze i systemy eksperymentalne są wykorzystywane w laboratoriach badawczych i diagnostycznych wyłącznie do oznaczania przeciwciał (na przykład metody serologiczne), podczas gdy inne wykorzystują metody biologii molekularnej, inżynierii genetycznej, metody hodowli komórkowych i modele zwierzęce, które są w dużej mierze przyczynić się do zrozumienia fizjologii i patofizjologii układu odpornościowego.

W 2000 roku odkryto sekwencję ludzkiego genomu. Dzięki aktywnym próbom rozszyfrowania sekwencji genomów mikroorganizmów pojawiły się obiecujące podejścia do badań układu odpornościowego - badania z wykorzystaniem bioinformatyki i biologii obliczeniowej (tzw. Eksperymenty na krzemionce). Technologie te są oparte na danych z badań genomiki i proteinomiki oraz wykorzystują potężne programy komputerowe i algorytmy obliczeniowe. Są bardzo obiecujące w immunologii..

Jest to szczególnie ważne przy próbie identyfikacji immunogennych epitopów eksprymowanych przez patogeny, które można później wykorzystać do uzyskania szczepionek. Chociaż temat ten wykracza poza zakres tego rozdziału, należy pamiętać, że przyszłe postępy w immunologii będą wynikać z połączenia technik badawczych in vitro, in vivo i krzemionki..

Interakcje antygen - przeciwciało

Reakcja między antygenem a przeciwciałami surowicy (serologia) jest podstawą wielu badań immunologicznych. Ze względu na ścisłą specyfikę odpowiedzi immunologicznej do celów diagnostycznych, wykrywania i identyfikacji antygenów lub przeciwciał, szeroko stosuje się interakcję między antygenem a przeciwciałem in vitro Przykładem zastosowania metod serologicznych do identyfikacji i klasyfikacji antygenów jest serotypowanie mikroorganizmów przy użyciu specyficznej surowicy odpornościowej..

Interakcja antygenu z przeciwciałami może prowadzić do różnych konsekwencji, w tym wytrącania (jeśli antygen jest rozpuszczalny), aglutynacji (jeśli antygen jest cząstką stałą) i aktywacji dopełniacza. Wszystkie te wyniki są wynikiem interakcji między wielowartościowymi antygenami i przeciwciałami, które mają co najmniej dwa miejsca wiązania antygenu. Wymienione reakcje, które rozwijają się podczas interakcji antygen-przeciwciało, nie są charakterystyczne dla pierwotnej odpowiedzi przeciwciał na odpowiadające im epitopy antygenowe, ale w większym stopniu odzwierciedlają zdarzenia, które rozwijają się podczas powtarzanej interakcji wielowartościowych antygenów z przeciwciałami..

Zjawiska, takie jak tworzenie osadów, aglutynacja i aktywacja komplementu, pojawiają się, gdy przeciwciało z dwoma lub więcej miejscami wiązania zareaguje z haptenem (na przykład antygen z pojedynczą determinantą jest jednowartościowy); jednakże są one inicjowane przez oddziaływanie jednowartościowych fragmentów przeciwciał (np. Fab) z antygenem, nawet jeśli antygen jest wielowartościowy. Przyczyny tych różnic przedstawiono na rys. 5.1.

Figa. 5.1. Interakcje między przeciwciałami lub fragmentami przeciwciał a antygenami lub haptenami

W celu wytrącenia, aglutynacji lub aktywacji komplementu wymagane jest, aby przeciwciała sieciowały różne cząsteczki antygenu, co jest możliwe tylko wtedy, gdy antygen jest wielowartościowy, a przeciwciało jest dwuwartościowe (albo nienaruszone przeciwciała, albo fragment F (ab ') 2 składający się z dwóch miejsc wiązania antygenu) ( patrz rysunek 5.1). W przeciwieństwie do tego, sieciowanie nie jest możliwe, jeśli antygen lub przeciwciało są jednowartościowe.

Pierwotne interakcje między przeciwciałem a antygenem

Wiązania kowalencyjne nie są zaangażowane w interakcję między przeciwciałem a epitopem antygenowym. W rezultacie siły, które je wiążą, są stosunkowo słabe. Należą do nich głównie Wonder Waals, siły elektrostatyczne i hydrofobowe; wymagają bardzo bliskiego podejścia między oddziałującymi elementami.

Zatem epitop antygenu i przeciwciało muszą dokładnie pasować do interakcji, co często porównuje się z interakcją klucz-zamek. Ze względu na to, że w interakcję między antygenem a przeciwciałem zaangażowane są słabe siły, kompleks antygen - przeciwciało może łatwo dysocjować pod wpływem niskiego lub wysokiego pH, hiperosmolarności roztworu lub jonów chaotropowych (np. Pianaty), które skutecznie niszczą wiązania wodorowe cząsteczek wody.

Stała asocjacyjna

Dogodnie jest rozważyć interakcję między przeciwciałem a epitopem antygenowym na przykładzie reakcji między przeciwciałem a jednowartościowym haptenem. Ponieważ cząsteczka przeciwciała jest symetryczna i ma dwa identyczne fragmenty Fab wiążące antygen, gdy jedna cząsteczka przeciwciała wiąże się z dwoma identycznymi jednowartościowymi haptenami, każdy fragment Fab niezależnie wiąże się z jedną cząsteczką haptenu. Wiązanie monowalentnego antygenu (Ag) z każdym miejscem przeciwciała można przedstawić za pomocą następującego równania:

gdzie k1 jest bezpośrednią stałą (asocjacją); - stała odwrotna (dysocjacja); Ab - przeciwciało.
Stosunek k1 / k-1 jest asocjacyjną stałą K, miarą powinowactwa (powinowactwa). Można go obliczyć ze stosunku stężenia związanych kompleksów antygen-przeciwciało do stężenia niezwiązanych (wolnych) antygenów i przeciwciał.

Stała asocjacji (K) jest rzeczywiście miarą powinowactwa (powinowactwa) przeciwciała i epitopu antygenowego. Gdy wszystkie przeciwciała, które wiążą odpowiednie hapteny lub antygenowe epitopy są identyczne (jak w przypadku przeciwciał monoklonalnych), wówczas stała K jest wewnętrzną stałą asocjacji. Jednak ze względu na fakt, że przeciwciała w surowicy, nawet te, które oddziałują tylko z jednym epitopem, są heterogeniczne, średnia stała asocjacji wszystkich przeciwciał z epitopami jest oznaczona jako K0.

Interakcja między przeciwciałami a każdym epitopem wielowartościowego antygenu podlega kinetyce i siłom podobnym do tych związanych z oddziaływaniem między przeciwciałami i haptenami, ponieważ każdy epitop antygenu reaguje z odpowiednim przeciwciałem w taki sam sposób, jak opisano wcześniej.

Stałą asocjacji można określić metodą dializy równowagowej. W tym celu stosuje się komorę dializacyjną z dwoma przedziałami, oddzielonymi półprzepuszczalną membraną, przez którą mogą swobodnie przenikać cząsteczki o odpowiedniej wielkości. Przeciwciała są umieszczane po jednej stronie membrany półprzepuszczalnej i nie mogą przez nią przenikać ze względu na ich duży rozmiar. Po drugiej (antygenowej) stronie błony dodaje się znaną liczbę małych rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie haptenów, oligosacharydów lub oligopeptydów, dostarczających epitopów złożonych węglowodanów lub białek.

W momencie startu, zastosowany hapten lub epitop antygenowy (zwany dalej ligandem) zaczyna dyfundować przez błonę; po osiągnięciu równowagi stężenie wolnych ligandów będzie takie samo po obu stronach membrany. Jednak całkowita liczba ligandów będzie większa po stronie, po której znajdują się przeciwciała, ponieważ niektóre z ligandów będą wiązać się z cząsteczkami przeciwciał. Różnica w stężeniu ligandów w dwóch przedziałach komory dializacyjnej odzwierciedla stężenie ligandów związanych z przeciwciałami (tj. Kompleksów antygen-przeciwciało). Im wyższe powinowactwo przeciwciał, tym więcej wiąże się ligandów.

Ponadto w tym badaniu można zastosować różne stężenia ligandów, ponieważ stężenie przeciwciał umieszczonych w komorze dializacyjnej można z góry określić i pozostaje stałe. Takie podejście jest stosowane w tzw. Metodzie Scatcharda. Znajduje zastosowanie w sytuacji, gdy konieczne jest ustalenie, czy badane preparaty przeciwciał są homogeniczne (np. Przeciwciała monoklonalne) czy heterogeniczne (np. Poliklonalna surowica odpornościowa), czy też zmierzenie średniej stałej powinowactwa (K0).

Powinowactwo i awidność

Jak wspomniano wcześniej, wewnętrzna stała asocjacji charakteryzująca połączenie przeciwciała z antygenowym epitopem lub haptenem jest definiowana jako powinowactwo, powinowactwo. Jeśli antygen składa się z wielu powtarzających się identycznych epitopów lub jest wielowartościowy, oddziaływanie między całą cząsteczką antygenu a przeciwciałem zależy nie tylko od powinowactwa każdego epitopu i odpowiadającego mu przeciwciała, ale także od całkowitego powinowactwa wszystkich zaangażowanych epitopów. Na przykład powinowactwo wiązania przeciwciała anty-A z wielowartościowym antygenem A może być o cztery do pięciu rzędów wielkości wyższe niż powinowactwo wiązania tego samego przeciwciała (tj. Anty-A) z jednowartościowym antygenem A (patrz rys. 5.1).

Powodem jest to, że parowanie przeciwciał anty-A z antygenem A jest wzmocnione przez wzrost liczby miejsc antygenu A, z którymi mogą reagować przeciwciała anty-A.
Termin „powinowactwo” odnosi się do wewnętrznej stałej asocjacji między przeciwciałem a jednowartościowym ligandem, takim jak hapten, a termin „zachłanność” jest stosowany w odniesieniu do całkowitej siły wiązania między przeciwciałami a wielowartościowym antygenem. Zatem z reguły przeciwciała IgM mają większą awidność niż przeciwciała IgG, chociaż połączenie każdego fragmentu Fab cząsteczki IgM z ligandem może mieć takie samo powinowactwo jak fragment Fab cząsteczki IgG..

Wtórne interakcje między przeciwciałami i antygenami

Reakcje aglutynacji

Aglutynacja antygenów, gdy są one usieciowane przez przeciwciała, zależy od prawidłowego stosunku między ilością antygenu i przeciwciał. Jedną z technik stosowanych czasami do pomiaru poziomu przeciwciał w surowicy swoistych dla antygenów w postaci cząstek jest test aglutynacji. Bardziej czułe testy ilościowe (np. Test immunoenzymatyczny, omówiony poniżej) w dużej mierze wyparły tę technologię pomiaru przeciwciał w surowicy..

Rzeczywiście, miareczkowanie aglutynacji konkretnej surowicy pozwala tylko na półilościowe oznaczenie przeciwciał obecnych w surowicy; nie jest to sposób na ilościowe określenie stężenia przeciwciał (stosunek masy do objętości). Badanie to przeprowadza się przez zmieszanie dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń surowicy ze stałym antygenem. Wysokie rozcieńczenia surowicy zwykle nie powodują aglutynacji antygenu, ponieważ przy takich rozcieńczeniach zawartość przeciwciał jest niewystarczająca do rozwinięcia zauważalnej, wizualizowanej aglutynacji.

Najwyższe rozcieńczenie surowicy, które daje aglutynację i po którym aglutynacja nie rozwija się, nazywa się mianem. Często zdarza się, że aglutynacja nie rozwija się nawet przy wysokich stężeniach przeciwciał, chociaż przy większym rozcieńczeniu surowicy taka reakcja zachodzi. Probówki z wysokim stężeniem surowicy, które nie ulegają aglutynacji, nazywane są prozonem. W tej prozone występuje wiele przeciwciał. Aglutynacja może nie rozwinąć się przy wysokim stosunku przeciwciał do antygenu, ponieważ każdy epitop na cząstce jest związany z oddzielną cząsteczką antygenu, co zapobiega sieciowaniu między różnymi cząstkami.

Ze względu na zjawisko prozonu przy oznaczaniu aglutynacji przeciwciał do określonego antygenu konieczne jest badanie surowicy w kilku rozcieńczeniach. Badanie surowic tylko w jednym rozcieńczeniu może prowadzić do nieuzasadnionych wniosków w przypadku braku aglutynacji, ponieważ oznacza to zarówno prozon, jak i brak przeciwciał.

potencjał zeta

Powierzchnia niektórych antygenów ciałkowych może mieć ładunki elektryczne, takie jak sieć ładunków ujemnych na powierzchni krwinek czerwonych, utworzona przez reszty kwasu sialowego. Kiedy te naładowane cząstki są zanurzone w roztworze soli, powstaje między nimi potencjał elektryczny, zwany potencjałem zeta, który zapobiega zbytniemu zbliżeniu się cząstek. Potencjał ten zapobiega aglutynacji naładowanych cząstek przez przeciwciała, zwłaszcza erytrocyty, przez przeciwciała klasy IgG. Odległość między fragmentami Fab w cząsteczce IgG, nawet przy maksymalnej odległości, jest zbyt mała, aby skutecznie związać dwie czerwone krwinki i pokonać potencjał zeta.

Tak więc, chociaż IgG może być skierowane przeciwko antygenom na ujemnie naładowanej powierzchni erytrocytów, aglutynacja nie może rozwinąć się z powodu odpychania ze względu na potencjał zeta. Jednocześnie niektóre fragmenty Fab w pentamerze IgM są wystarczająco oddalone od siebie i mogą wiązać erytrocyty oddzielone potencjałem zeta. Ta właściwość przeciwciał klasy IgM, podobnie jak pięciowartościowa, jest głównym powodem ich skuteczności jako przeciwciał-aglutynin.

Od wielu lat podejmowano próby usprawnienia reakcji aglutynacji poprzez redukcję potencjału zeta różnymi metodami, ale żadna z nich nie stała się uniwersalna ani wystarczająco skuteczna. Jednak w latach pięćdziesiątych XX wieku. R. Coombs zaproponował metodę, która wyeliminowała ten problem. Opisana poniżej metoda ułatwia aglutynację erytrocytów przeciwciałami IgG swoistymi dla antygenów powierzchniowych erytrocytów. Może być również stosowany do wykrywania nieaglutynujących przeciwciał, które są obecne na powierzchni erytrocytów..

Test Coombsa

Test Coombsa wykorzystuje przeciwciała przeciwko immunoglobulinom (dlatego czasami nazywany jest testem anty-immunoglobulinowym). Opiera się na dwóch ważnych faktach: 1) immunoglobuliny jednego gatunku biologicznego (na przykład człowieka) są immunogenne, gdy zostaną wprowadzone do organizmu innego gatunku biologicznego (na przykład królika) i prowadzą do wytworzenia przeciwciał przeciwko immunoglobulinom; 2) większość antyimmunoglobulin (na przykład królicze przeciwciała przeciwko ludzkiej Ig) wiąże się z determinantą antygenową na fragmencie Fc przeciwciał, pozostawiając fragmenty Fab wolne do reakcji z antygenem.

Na przykład, jeśli ludzkie IgG są związane z odpowiadającymi im epitopami na powierzchni erytrocytów, wówczas dodanie przeciwciał króliczych do ludzkich IgG doprowadzi do ich wiązania z fragmentami Fc ludzkich przeciwciał już przyłączonych do erytrocytów za pomocą fragmentów Fab (ryc. 5.2). Te królicze przeciwciała nie tylko wiążą się z ludzkimi przeciwciałami, z kolei już związanymi z erytrocytami, ale także tworzą wiązania krzyżowe (mostki) między ludzkimi przeciwciałami zlokalizowanymi na stosunkowo odległych erytrocytach, pokonując separację ze względu na potencjał zeta, co prowadzi do aglutynacja. Dodatek anty-immunoglobulin powoduje aglutynację, nawet jeśli przeciwciała skierowane przeciwko erytrocytom są obecne w wystarczająco wysokich stężeniach, aby wywołać zjawisko prozone.

Figa. 5.2. Test Coombsa (anty-immunoglobulina)

Istnieją dwa warianty reakcji Coombsa: bezpośrednie i pośrednie testy Coombsa. Te dwie wersje różnią się nieco pod względem techniki, ale obie opierają się na tej samej zasadzie: zastosowaniu heterologicznych anty-immunoglobulin do wykrywania interakcji antygenu i przeciwciała. W bezpośrednim teście Coombsa anty-immunoglobuliny są dodawane do cząstek (np. Krwinek czerwonych) w celu wykrycia przeciwciał związanych z antygenami na ich powierzchni. Na przykład ten test jest stosowany, gdy noworodek podejrzewa się o chorobę hemolityczną wywołaną przez matczyne przeciwciała IgG anty-RҺ związane z czerwonymi krwinkami niemowlęcia..

Aby udowodnić słuszność takich podejrzeń, w bezpośrednim teście Coombsa należy uzyskać następujące wyniki: dodanie antyimmunoglobulin do zawiesiny erytrocytów dziecka poprzez wiązanie przeciwciał matczynych z przeciwciałami matczynymi na powierzchni erytrocytów powinno spowodować aglutynację. Pośredni test Coombsa służy do wykrywania przeciwciał w surowicy, które są specyficzne dla antygenów na cząsteczkach. Dodanie przeciwciał surowicy do cząstek może nie prowadzić do aglutynacji ze względu na obecność potencjału zeta. Późniejsze dodanie anty-immunoglobulin z pewnością spowoduje aglutynację.

Najczęściej do wykrywania przeciwciał IgG przeciwko czynnikowi Rh we krwi kobiet Rh ujemnych stosuje się pośredni test Coombsa, który obejmuje po pierwsze reakcję surowicy kobiety z erytrocytami Rh dodatnimi, po drugie dodanie odczynnika z anty-immunoglobuliną (jak w bezpośredni test Coombsa). Tak więc, bezpośredni test Coombsa wykrywa związane przeciwciała, podczas gdy test pośredni wykrywa surowicę.

Początkowo nazwa „test Coombsa” była używana do określenia reakcji wykrywania ludzkich przeciwciał na powierzchni krwinek czerwonych. Obecnie termin ten jest używany w odniesieniu do wszelkich reakcji mających na celu wykrycie jakichkolwiek immunoglobulin związanych z antygenami za pomocą anty-immunoglobuliny..

Aglutynacja pasywna

Reakcja aglutynacji może być przeprowadzona z antygenami ciałkowymi (na przykład krwinkami czerwonymi lub bakteriami) i rozpuszczalnymi alergenami, jeśli rozpuszczalny antygen można bezpiecznie przymocować do nierozpuszczalnej cząsteczki.

Na przykład rozpuszczalny antygen tyreoglobulina może być utrwalony na cząstkach lateksu, a następnie dodanie przeciwciał do tyreoglobuliny doprowadzi do aglutynacji cząstek lateksu pokrytych tyreoglobuliną. Oczywiście, dodanie rozpuszczalnego antygenu do przeciwciał przed ich interakcją z cząstkami lateksu pokrytymi tyreoglobuliną hamuje aglutynację, ponieważ przeciwciała najpierw wiążą się z rozpuszczalnym antygenem. Jeśli rozpuszczalny antygen występuje w nadmiarze, przeciwciała na ogół nie będą w stanie związać się z antygenem związanym z powierzchnią cząstek.

Ostatni przykład nazywa się hamowaniem aglutynacji. Konieczne jest rozróżnienie między taką supresją a przypadkami, w których przeciwciała przeciwko niektórym wirusom zapobiegają aglutynacji erytrocytów przez same cząsteczki wirusa. W takiej sytuacji przeciwciała są kierowane na fragment lub odcinki otoczki wirusa, które wiążą się z odpowiednimi receptorami na krwinkach czerwonych.

Jeśli antygen jest naturalnym składnikiem cząsteczki, reakcję nazywa się aglutynacją bezpośrednią. Jeśli reakcja zachodzi między przeciwciałami a rozpuszczalnym antygenem, który został wcześniej utrwalony na nierozpuszczalnych cząstkach, reakcję nazywa się pasywną aglutynacją.

Reakcja aglutynacji (bezpośrednia lub pośrednia, z testem Coombsa lub bez) jest szeroko stosowana w praktyce klinicznej. Oprócz podanych już przykładów wymieniamy typowanie erytrocytów w bankach krwi, diagnostykę różnych chorób hemolitycznych o podłożu immunologicznym (takich jak anemia autohemolityczna wywołana lekami), test czynnika reumatoidalnego (ludzkie IgM do ludzkich przeciwciał IgG), testy diagnostyczne na kiłę i lateks test wykrywający ciążę. Ten ostatni ma na celu wykrycie ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej w moczu kobiety w ciąży.

Reakcje strącania

Reakcje w roztworach

W przeciwieństwie do reakcji aglutynacji, które zachodzą między przeciwciałami a antygenami ciałkowymi, reakcje strącania rozwijają się, gdy mieszają się przeciwciała i rozpuszczalne antygeny. Podobnie jak w przypadku aglutynacji, wytrącanie kompleksów antygen-przeciwciało rozwija się ze względu na fakt, że cząsteczki dwuwartościowych przeciwciał są w stanie wiązać się z wielowartościowymi cząsteczkami antygenu, tworząc siatkę.

Po osiągnięciu określonej wielkości, kompleks polimolekularny antygen-przeciwciało przestaje być rozpuszczalny i wytrąca się z roztworu.

Na rys. 5.3 przedstawia ilościową charakterystykę reakcji strącania. Po dodaniu roztworu o rosnącym stężeniu antygenu do kilku probówek zawierających roztwór przeciwciał o stałym stężeniu zmienia się ilość osadu. Masę osadu w każdej z rur można zmierzyć różnymi metodami..

Przedstawiając graficznie masę osadu w stosunku do ilości dodanego antygenu, otrzymujemy krzywą wytrącania podobną do pokazanej na ryc. 5.3.

Figa. 5.3. Reakcja wytrącania

Trzy strefy pod krzywą pokazaną na rys. 5,3: 1) nadmiar przeciwciał; 2) równoważność; 3) nadmiar antygenów. W strefie równoważności stosunek antygenów i przeciwciał jest optymalny dla maksymalnego wytrącenia; w obszarach, w których występuje nadmiar przeciwciał lub antygenów, stosunek odczynników nie prowadzi do skutecznego usieciowania i nie tworzy się osad.

Należy podkreślić, że strefy na krzywej wytrącania wybrano na podstawie ilości wytrąconych kompleksów antygen-przeciwciało. Jednak strefy nadmiaru antygenów lub przeciwciał mogą zawierać rozpuszczalne kompleksy antygen-przeciwciało; w szczególności w obszarze nadmiaru antygenów, gdy tworzy się mała ilość osadu, większość kompleksów antygen-przeciwciało jest obecna w supernatancie. Zatem ilość utworzonego osadu zależy od stosunku między reaktywnymi antygenami i przeciwciałami. Właściwa proporcja odczynników prowadzi do powstania maksymalnej ilości osadu; nadmiar antygenów (lub przeciwciał) prowadzi do powstania rozpuszczalnych kompleksów.

Reakcje strącania w żelach

Reakcje wytrącania między rozpuszczalnymi antygenami i przeciwciałami mogą rozwijać się nie tylko w roztworach, ale także na półstałych podłożach, takich jak żel agarowy. Po dodaniu rozpuszczalnych antygenów i przeciwciał do dołków w żelu (ryc. 5.4, A). odczynniki zaczynają do niej dyfundować, aw bezpośrednim sąsiedztwie komórki stężenie substancji jest największe i maleje wraz z odległością. W pewnej odległości od obu komórek reagujące antygeny i przeciwciała spotkają się w stężeniach, które są optymalne do tworzenia osadu.

Figa. 5.4. (A) Dyfuzja w żelu: przeciwciała i jeden antygen. (B) Dyfuzja w żelu: przeciwciała i antygeny 1, 2, 3

Jeśli przedział przeciwciał zawiera mieszaninę przeciwciał 1, 2 i 3, specyficznych odpowiednio dla antygenów 1, 2 i 3, a zdolność dyfuzji antygenów jest inna (współczynnik dyfuzji 1> 2> 3), wówczas linie precypitacji utworzą się w trzech różnych pozycjach. Powstają ze względu na to, że przeciwciała anty-1, anty-2 i anty-3 reagują odpowiednio z antygenami 1, 2 i 3 w trzech różnych strefach równoważności (ryc. 5.4, B). Różnice w szybkości dyfuzji antygenów i przeciwciał są związane z różnicami w stężeniu, wielkości lub kształcie cząsteczek..

Metoda podwójnej dyfuzji, opracowana przez O. Ouchterlony (O. Ouchterlony) (ta nazwa jest czasami używana do opisu metody zamiast terminu „podwójna dyfuzja”), w której przeciwciało i antygen dyfundują względem siebie, jest bardzo przydatna w określaniu interakcji antygenowych między różnymi substancjami. Istnieją trzy warianty reakcji podczas dyfuzji do żelu (ryc. 5.5): tożsamość, różnica w antygenach i częściowa tożsamość. W przypadku, gdy właściwości antygenowe cząsteczek pokrywają się, reakcja przebiega zgodnie z modelem tożsamości.

Figa. 5.5. Warianty podwójnej dyfuzji w żelu: tożsamość (A), różnice (B) i częściowa identyczność (C) antygenów

Przecięcie się linii opadów ze sobą odpowiada modelowi, w którym antygeny różnią się od siebie. Wreszcie w przypadku, gdy antygeny nie są całkowicie identyczne, tj. zawierają epitopy odpowiadające i nie odpowiadające przeciwciałom, w żelu tworzy się linia precypitacji podobna do ostrogi.

Promieniowa immunodyfuzja

Test promieniowej immunodyfuzji jest odmianą testu podwójnej dyfuzji (rysunek 5.6). Studzienki zawierają antygen w różnych stężeniach, a przeciwciała są równomiernie rozmieszczone w żelu agarowym, tak więc linia precypitacji wygląda jak pierścień wytrącania wokół dołka. Odległość, na jaką pierścień wytrącający przemieszcza się od środka komórki, jest wprost proporcjonalna do stężenia w niej antygenu. Zależność między stężeniem antygenu w studzience a średnicą pierścienia wytrącającego można przedstawić graficznie (patrz rys. 5.6).

Jeśli komórki, na przykład F i G, zawierają nieznaną ilość dowolnego antygenu, jego stężenie można określić porównując średnice pierścieni precypitacyjnych ze średnicą pierścienia utworzonego przez komórkę o znanym stężeniu antygenu..

Figa. 5.6. Dyfuzja promieniowa. Komórki A, B, C, D i E zawierają znane stężenia antygenu; F i G to nieznane stężenia, które można obliczyć za pomocą wykresu

W klinice do oznaczania stężenia białek surowicy stosowana jest metoda radialnej immunodyfuzji. W tym celu do żelu wstrzykuje się przeciwciała przeciwko różnym białkom surowicy krwi: stężenie określonego białka określa się, porównując średnicę utworzonego pierścienia precypitacyjnego ze średnicą pierścienia uzyskanego przy użyciu badanego białka o znanym stężeniu.

Immunoelektroforeza

Immunoelektroforeza to rozdzielenie mieszaniny białek za pomocą pola elektrycznego (elektroforeza), a następnie oznaczenie tych białek za pomocą przeciwciał dyfundujących w żelu. Ta metoda jest bardzo wygodna w użyciu podczas analizy mieszaniny antygenów przy użyciu roztworu zawierającego przeciwciała przeciwko antygenom badanej mieszaniny. Na przykład, w klinicznej charakterystyce białek surowicy ludzkiej, niewielką kroplę surowicy pacjenta umieszcza się w zagłębieniu pośrodku paska pokrytego żelem agarowym. Surowicę poddaje się następnie elektroforezie, która rozdziela poszczególne składniki na podstawie ich ruchliwości w polu elektrycznym..

Po elektroforezie wzdłuż krawędzi paska wycina się rowek, w którym umieszcza się przeciwciała przeciwko białkom surowicy ludzkiej. Te przeciwciała dyfundują w agarze, podobnie jak oddzielone białka surowicy. Przy optymalnym stosunku antygenu i przeciwciał dla każdego antygenu i odpowiednich przeciwciał tworzy się linia precypitacji. W rezultacie pojawia się obraz, którego próbkę pokazano na ryc. 5.7.

Porównując rozmieszczenie i intensywność linii utworzonych przez surowicę osoby zdrowej i uzyskanych w badaniu próbek surowicy od pacjentów, można wykazać brak, nadmiar lub inny rodzaj zmian w jednym lub kilku białkach surowicy. Rzeczywiście, to za pomocą metody immunoelektroforezy w 1952 roku po raz pierwszy zidentyfikowano zespół niedoboru przeciwciał (agammaglobulinemia Brutona).

Figa. 5.7. Immunoelektroforeza białek surowicy

Western blot (immunoblotting)

W technice Western blot (immunoblotting) w pierwszym etapie antygen (lub mieszanina antygenów) jest rozdzielany w żelu za pomocą elektroforezy. Oddzielony materiał jest następnie przenoszony (blotowany) na arkusze zdolne do wiązania białka (np. Z nitrocelulozy). Następnie na arkusz nitrocelulozowy nanosi się przeciwciała, które wiążą się ze specyficznymi dla nich antygenami. Przeciwciała są znakowane, na przykład, izotopami radioaktywnymi. Jeśli potrzebujesz zidentyfikować lokalizację kompleksu przeciwciało-antygen, do którego jest przyłączone pierwsze przeciwciało, użyj znakowanych przeciwciał przeciwko immunoglobulinom.

Technika ta, zwana Western blotting, jest szeroko stosowana w badaniach i laboratoriach klinicznych do identyfikowania i charakteryzowania antygenów. W szczególności metoda Western blot służy do potwierdzenia rozpoznania zakażenia HIV. Surowice pacjentów umieszcza się na arkuszu nitrocelulozowym, na którym są umieszczone antygeny HIV. Wykrywanie specyficznych przeciwciał jest mocnym dowodem infekcji wirusowej (Rysunek 5.8).

Figa. 5.8. Wyniki immunoblottingu surowic dwóch osób zakażonych wirusem HIV i jednej zdrowej osoby